سراشیا مارسه سنس یک باسیل گرم منفی از خانواده بزرگ انتروباکتریاسه می‌باشد، که با توجه به تولید سه آنزیم خاص شامل DNAase، Lipase و gelatinase از سایر گونه‌ها تشخیص داده می‌شود
رساله دکترای رشته پزشکی با عنوان تولید، خالص‌سازی، تعیین ساختمان و بررسی اثرات سمیت سلولی پیگمان تولید شده توسط سویه سراشیا مارسه‌سنس PTCC 1111
خلاصه فارسی :
سراشیا مارسه سنس یک باسیل گرم منفی از خانواده بزرگ انتروباکتریاسه می‌باشد، که با توجه به تولید سه آنزیم خاص شامل DNAase، Lipase و gelatinase از سایر گونه‌ها تشخیص داده می‌شود. ویژگی دیگر این باکتری تولید یک پیگمان قرمز رنگ درون سلولی به نام prodigiosin می‌باشد. این پیگمان به دلیل داشتن اثرات ضدقارچی، ضد باکتریایی و ضد پروتوزوآیی به عنوان یک داروی پر آتیه مطرح می‌باشد. امروزه انواع بدخیمی‌ها و سرطان‌ها از علل شایع مرگ و میر در سراسر دنیا می‌باشند که درمان آنها نیز تا به حال موفقیت آمیز نبوده است. یکی از مشکلات علم پزشکی شکست دارو درمانی در درمان سرطان است، این شکست می‌تواند به دلیل عدم تحمل دارو از طرف بیمار، عوارض شیمی درمانی و یا بروز مقاومت دارویی باشد.
بر این اساس و همچنین به علت پیامدهای اجتماعی سرطان، جامعه پزشکی امروزه به دنبال شناسایی تارگت‌های جدید و ترکیباتی با سمیت کمتر و اثر بخشی بیشتر نسبت به عوامل شیمی درمانی که در حال حاضر استفاده می‌شود می‌باشند و از آنجایی که با استفاده از میکروارگانیسم‌ها می‌توان به داروهای ضد سرطان با اثرات اختصاصی‌تر و سمیت کمتر برای انسان دست یافت که روش‌های تولید آنها نیز مقرون به صرفه می‌باشد، لذا هدف از این پایان نامه تولید، خالص‌سازی، تعیین ساختمان و بررسی اثرات سمیت سلولی پیگمان تولید شده توسط سویه سراشیا مارسه‌سنس PTCC 1111 می‌باشد.
به منظور تولید پیگمان، باکتری در محیط نوترینت براث کشت داده شد و به مدت 5 روز در دمای 28، گرمخانه گذاری گردید. سپس محیط کشت سانتریفوژ شد و پیگمان با استفاده از اتانول اسیدی از داخل سلول‌ها استخراج گردید. به منظور خالص‌سازی پیگمان از کروماتوگرافی ستونی استفاده شد. با استفاده از طیف و LC/MS مشخص شد که این پیگمان یک ترکیب تری پیرولی با اسکلت pyrrolypyrromethen و یک گروه متوکسی در موقعیت 4 و وزن مولکولی Da 323 می‌باشد.آزمایشات سمیت سلولی بر روی دو رده سلولی HT29 و T47D با استفاده از آزمون MTT انجام شد و مشخص شد که Prodigiosin بر روی هر دو رده سلولی HT29 و T47D اثر مهار کنندگی رشد قابل قبولی داشته که این اثر مهارکنندگی، اثری وابسته به غلظت و زمان بوده و با افزایش غلظت و مدت زمان مجاورت، این اثر افزایش می‌یابد. لازم به ذکر است که اثر مهار کنندگی رشد prodigiosin بر روی سلول‌های HT29 به طور مشهودی بیشتر از سلول‌های T47D بوده است. با توجه به نتایج به دست آمده چنین به نظر می‌رسد که prodigiosin این پتانسیل را دارد که برای طراحی داروهای ضد سرطان جدید مورد مطالعه قرار گیرد.
کلمات کلیدی:
پیگمان
سرطان
prodigiosin
سمیت سلولی
محیط نوترینت براث
کروماتوگرافی ستونی
سویه سراشیا مارسه‌سنس PTCC 1111
1-1- اهمیت مسأله
بیماری سرطان یکی از معضلات اصلی طب کنونی و از علل عمده مرگ و میر در جهان است. لذا با توجه به گسترش انواع سرطان ها در جوامع بشری امروزی، شناسایی تارگت های جدید و طراحی و توسعه عوامل شیمی درمانی اختصاصی تر دو هدف بسیار مهم در تحقیقات به منظور یافتن داروهای ضد سرطان با اثر بخشی بیشتر و سمیت کمتر می باشد.یک خانواده از پیگمان های قرمز رنگ توسط گروهی از باکتری ها از جمله سراشیا مارسه سنس تولید می شود که اخیراً اثرات بیولوژیکی مختلفی مانند اثرات ضد باکتریایی، ضد قارچی، ضد پروتوزوآیی و سمیت سلولی بر روی برخی از رده های سلول های سرطانی مانند سرطان کولون، پستان ،ریه و ... برای آنها گزارش شده است (1).
تحقیقات انجام شده حاکی از آن است که این پیگمان ها باعث افزایش مرگ سلولی به صورت اختصاصی (آپاپتوز) در سلول های سرطانی می شوند، در حالی که هیچ گونه سمیت بارزی روی سلول های غیر بدخیم ندارند. با توجه به خصوصیات ضد سرطانی این خانواده انستیتو ملی سرطان (NCI) هم اثرات سایتوتوکسیک ترکیبات طبیعی این خانواده را تایید کرده است(2).از آنجایی که با استفاده از میکروارگانیسم ها می توان به داروهای ضد سرطانی با اثرات اختصاصی تر و سمیت کمتر برای انسان دست یافت که روش های تولید آنها نیز مقرون به صرفه می باشد لذا تولید، خالص سازی و تعیین ساختمان پیگمان تولید شده توسط سویه سراشیا مارسه- سنس1111 PTCCکه بومی ایران می باشد و بررسی اثرات سمیت سلولی آن بر روی برخی رده های سلول های سرطانی به منظور توسعه داروهایی با پتانسیل بالای درمان سرطان از اهمیت و ضرورت خاصی برخوردار می باشد.
فهرست مطالب
خلاصه فارسی 3
فصل اول 6
کلیات 6
فصل اول : کلیات 6
1-1- اهمیت مسأله 6
1-2- بیان مسأله 9
1-3- اهمیت موضوع 11
فصل دوم:بررسی متون و مطالعات دیگران در این زمینه 13
2-1- با سیل های گرم منفی روده ای (انتروباکتریاسه) 13
2-1-2- طبقه بندی 14
2-1-3- اهمیت انتروباکتریاسه 15
2-1-4- مورفولوژی و شناسایی 16
2-1-5- صفات کشت 16
2-1-6- صفات بیوشیمیایی 18
جدول 2-1 صفات بیوشیمیایی در جنس های مهم از خانواده انتروباکتریاسه 18
2-1-7- ساختمان آنتی ژنی 19
شکل 2-1 – اجزای آنتی ژنی در انتروباکتریاسه 19
2-1-8- کلی سین ها (باکتریوسین ها) 19
2-1-9- بیماری های ایجاد شده توسط انتروباکتریاسه هایی غیر از سالمونلا و شیگلا 20
2-2- سراشیا مارسه سنس(Serratia marcescens) 21
2-2-1- خصوصیات ظاهری 21
شکل 2-2- باسیل های گرم منفی سراشیا مارسه سنس 24
شکل 2-3- تصویر میکروسکوپ الکترونی سراشیا مارسه سنس 24
2-2- 3- خصوصیات کشت 24
شکل 2-4- تولید پیگمان قرمز رنگ توسط سراشیا مارسه سنس در محیط کشت آگاردار 25
2-2-4- خواص بیوشیمیایی 25
2-2-6- بیوسنتز پیگمان توسط سراشیا مارسه سنس 26
2-3- عوامل موثر بر تولید پیگمان توسط سراشیامارسه سنس 31
2-3-1- دما 32
2-3-2- شرایط روشنایی : 33
2-3-3- حضور آنتی بیوتیک ها 34
2-3-4-2- منبع کربن 35
نمودار 2-3- تجمع پیگمان توسط سراشیامارسه سنس در محیط حاوی : گلیسیرول (-) و استات (●) 36
2-3-4-3- فسفات معدنی 38
2-3-5- فعالیت تنفسی 39
2-4- خصوصیات پیگمان تولید شده توسط سراشیا مارسه سنس 39
2-5- سرطان 42
2-5-2- تعریف سرطان 43
2-5-3- نامگذاری سرطان 44
2-5-4- چرخه سلولی 44
2-5-5- علل سرطان 47
2-5-6- روش های درمان سرطان 47
2-5-6-1- شیمی درمانی 47
2-5-6-1-1- داروهای ضد سرطان (آنتی نئوپلاستیک) 48
2-5-7- مقاومت در برابر داروهای سایتوتوکسیک 49
2-5-8- روش های غربال کردن داروهای ضد سرطانی 50
2-6- کلیات کشت سلول 52
2-6-1- مزایا و معایب کشت سلولی 52
2-6-2- آزمایش های بررسی رشد و سمیت سلولی 53
2-6-2-1- احیای رنگ های تترازولیوم 55
2-6-2-2 آزمون MTT 55
2-6-2-3- Trypan blue exclusion test 60
2-6-3- تجهیزات آزمایشگاه کشت سلولی 61
فصل سوم : مواد و روش‌ها 65
3-1- دستگاه‌ها و مواد مورد نیاز جهت تولید، استخراج، خالص‌سازی و تعیین ساختمان پیگمان 65
3-1-1- دستگاه‌ها 65
3-1-2- مواد و محیط های کشت 66
3-1-2-1- مواد شیمیایی 66
3-1-2-2- محیط‌های کشت 67
3-1-3- میکروارگانیسم 67
3-2-1- کشت و فعال‌سازی باکتری 67
3-2-2- کشت باکتری در محیط کشت نوترینت براث و گرمخانه‌گذاری در شرایط مناسب جهت تولید پیگمان 68
3-2-3- جداسازی سلول‌های باکتری از محیط کشت و استخراج پیگمان با استفاده از حلال آلی 68
3-2-3-1- روش قلیایی جهت استخراج پیگمان 68
3-2-3-2- روش اسیدی جهت استخراج پیگمان 69
3-2-4- بررسی خلوص پیگمان استخراج شده به کمک کروماتوگرافی لایه نازک (TLC) 70
3-2-4-1- سیستم حلال مناسب جهت TLC 70
3-2-4-2- ظاهر کردن و مشاهده لکه‌ها 71
3-2-5- خالص‌سازی پیگمان استخراج شده از سلول‌های باکتری 71
3-2-5-1- جداسازی فازها با استفاده از قیف دکانتور 71
3-2-6- بررسی خلوص پیگمان خارج شده از ستون 74
3-2-7- تعیین ساختمان پیگمان خالص شده با روش‌های دستگاهی 74
3-2-7-1- طیف سنجی مرئی و ماوراء بنفش 75
Resonance(NMR) Nuclear Magnetic 76
3-3- وسایل، مواد و دستگاه‌های مورد نیاز جهت انجام آزمایشات کشت سلولی 79
3-4- آماده‌سازی محلول‌ها جهت کشت سلولی 82
3-4-1- آماده‌سازی محیط کشت 82
جدول 3-1 : اجزای محیط کشت RPMI-1640 84
3-4-2- آماده سازی سرم جنین گاوی (FBS) 85
جدول 3-2 : اجزاء اصلی سرم (FBS) 86
جدول 3-3 : دیگر اجزاء ضروری سرم برای حیات و رشد سلولی در محیط خارج از بدن (60) 87
3-4-3- آماده سازی محلول‌های پنی سیلین G و استرپتومایسین 87
3-4-4- آماده‌سازی بافر PBS 88
3-4-5- آماده‌سازی رنگ تریپان بلو 89
3-4-6- آماده سازی محلول x1 تریپسین- EDTA 89
3-4-7- آماده‌سازی محلول MTT 90
3-4-8- آماده سازی رقت‌های دوکسوروبیسین 90
3-4-9- آماده‌سازی رقت‌های مختلف از نمونه پیگمان تخلیص شده 90
3-6- تعویض محیط کشت 92
3-7- پاساژ سلولی 93
3-8-1- توضیحاتی در مورد تانک ازت 98
3-9- شمارش مستقیم سلول‌ها به روش Trypan Blue Dye Exclusion 98
3-11- آزمایشات انجام شده 103
3-11-1- بررسی اثر غلظت‌های مختلف prodigiosin در مقایسه با دوکسوروبیسین بر رشد سلول‌های HT 29 در مدت 2، 3 و 4 روز مجاورت 103
3-11-2- بررسی اثر غلظت‌های مختلف prodigiosin در مقایسه با دوکسوروبیسین بر رشد سلول های T47D در مدت 2، 3 و 4 روز مجاورت 105
فصل چهارم : نتایج 106
4-1- تعیین ساختمان پیگمان خالص شده 106
4-1-1- طیف جذبی مرئی و ماوراء بنفش prodigiosin 106
شکل 4-2- ساختار prodigiosin 109
4-1-3- طیف LC/MS/MS ، prodigiosin 109
شکل 4-3- شکست های مولکول prodigiosin 110
4-2- نتایج کشت سلولی 110
4-2-1- بررسی اثر غلظت‌های مختلف prodigiosin در مقایسه با دوکسوروبیسین بر رشد سلول‌های HT29 در مدت 2، 3 و 4 روز مجاورت 111
نمودار 4-1- اثر غلظت های مختلف Prodigrosin در مقایسه با دوکسوروبیسین بر رشد سلول های HT29 در مدت 2، 3 و 4 روز مجاورت 112
نمودار 4-2- اثر غلظت های مختلف Prodigrosin در مقایسه با دوکسوروبیسین بر رشد سلول های T47D در مدت 2، 3 و 4 روز مجاورت 114
فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری 116
Abstract 124
منابع: 125
ضمایم 133